實驗準(zhǔn)備： 細(xì)胞，24孔板，細(xì)胞小室（8μm，24孔板專用），ECM Gel，10%FBS+培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套槍頭，1.5 mL EP管，冰盒
實驗設(shè)計：
實驗分組一般分為
陰性組（上下層均沒有趨化因素），
實驗組（按照實驗需要，上層或者下層加入趨化因素），
對照組（趨化因素與實驗組中的相反）。如果有特別需要，可以再加上
陽性組（上下層都有趨化因素）。
實驗操作（請細(xì)讀注意事項）：
一、細(xì)胞侵襲實驗
1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解凍，實驗前轉(zhuǎn)移到冰盒中。
2.將1.5 mL EP、槍頭盒、細(xì)胞小室放在24孔板里面后，置于冰上預(yù)冷。
3.根據(jù)自己的使用量，按照ECM Gel : 無血清培養(yǎng)基=1 : 7.5在冰上稀釋成使用液。
4.把槍頭剪去一小段（約3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液輕輕加入小室上室中，加入時慢慢移動槍頭，保證液體平鋪在底部。
5.放在37 ℃孵箱15 min，讓膠凝固。
6.消化、離心、計數(shù)細(xì)胞后，按照2.5x10^4 / mL用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（如果細(xì)胞很多，這一步可以提前，在4、5之前做）。
7.按照每孔200 μL，將細(xì)胞懸液加入小室上室，同時在小室下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μL，放入37 ℃孵箱培養(yǎng)。
8.若干小時后取出，吸去小室上室多余液體，用PBS清洗兩次，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。
9.在上室中加入結(jié)晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水緩緩沖去染液，再次用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干水分。 10.在正置顯微鏡上放置一塊載玻片，將細(xì)胞小室的小孔倒置放在上面，拍照。
11.在100倍視野下，對膜的上下左右及中間計數(shù)，做平均數(shù)。
二、細(xì)胞遷移實驗
細(xì)胞遷移實驗不需要ECM Gel包被，其余步驟一致。
實驗原理：多孔膜是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane），膜帶有微孔，孔徑大小有0.1－12.0 μm。將細(xì)胞小室放入對應(yīng)的培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動等的影響。
細(xì)胞遷移和侵襲實驗常用8.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室運(yùn)動，從而從多孔膜一側(cè)穿過，貼壁于多孔膜的另一側(cè)，計數(shù)其細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移或者侵襲能力（圓形透明小孔為微孔）。（注：遷移和侵襲是兩個概念，遷移是指細(xì)胞的運(yùn)動能力，而侵襲是細(xì)胞在運(yùn)動的同時會分泌出消化ECM的蛋白，清除運(yùn)動障礙，這個實驗更能模擬人體內(nèi)環(huán)境）
注意事項
1.ECM Gel（貨號：E1270）由Sigma公司生產(chǎn)，來源于大鼠肉瘤的細(xì)胞外基質(zhì)提取物，保存在-20℃，由于在室溫中會快速凝固，不可逆，因此需要在冰上溶解和操作，同時一切要與ECM Gel接觸的耗材也需要預(yù)冷，避免倆者接觸時溫差較大引起ECM Gel凝固粘附，造成浪費。
2.制作ECM Gel使用液時，先加入培養(yǎng)基，再加入ECM Gel；同時在使用量的基礎(chǔ)上多配置5-20 uL（使用量多就多配點），避免液體掛壁造成最后一次加樣不夠。
3.加膠時，膠的量以剛好把膠浸濕為最好（24孔的millicell需要35-40uL），過厚細(xì)胞侵襲變慢，過少則失去侵襲實驗的意義；完成后可輕輕地，均勻地拍打培養(yǎng)板四個側(cè)面，讓液體完全平鋪，這樣可以避免因為膠的厚薄不均而引起的誤差。
4.凝固時間可以適當(dāng)延長，但最好不要超過30min，防止液體揮發(fā)使gel凝固得過硬。
5.通常先根據(jù)細(xì)胞的侵襲能力估計每孔小室加入的細(xì)胞數(shù)量，侵襲能力強(qiáng)的細(xì)胞（如231，CAF）每孔加入5,000個，那最后的細(xì)胞懸液應(yīng)該制備成2.5x104/mL，而侵襲能力弱的細(xì)胞（如MCF-7）可以提高細(xì)胞數(shù)量，達(dá)到10,000個，那最后的細(xì)胞懸液應(yīng)該制備成5x104/mL。上層加入細(xì)胞懸液后可輕輕地，均勻地拍打培養(yǎng)板四個側(cè)面，讓液體完全平鋪，避免細(xì)胞分布不均而引起細(xì)胞計數(shù)時中間多兩邊少。
6.加入下室中的10%FBS是作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動，24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，氣泡處的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，小室在放入時傾斜緩慢放入（注意小室中的液體不要流出），可以避免氣泡。培養(yǎng)時間需要自己根據(jù)文獻(xiàn)做預(yù)實驗，尋找合適的時間點；時間點的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，細(xì)胞數(shù)及處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視，穿過的細(xì)胞數(shù)在100-200之間最好。棉簽清洗時一定要輕柔，防止戳破多孔膜。
7.結(jié)晶紫是細(xì)胞核染液，細(xì)胞大小不同，染色時間也有改變，染液放置的時間和濃度也會對染色時間有影響，需要自己掌握；最優(yōu)的染色狀態(tài)是細(xì)胞核顏色深，胞漿色淺。
