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2022-10-254099 次瀏覽
干細胞成骨誘導分化

間充質(zhì)干細胞屬于成體干細胞,可在體外通過不同的方法干預下下誘導分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織,因其來源廣泛,分離無創(chuàng)傷,較低的免疫原性、生長周期短等特點,是組織工程種子細胞的重要來源。干細胞的誘導分化一方面是干細胞鑒定的主要方法,另一方面也是干細胞功能學研究的主要途徑。采用體外條件培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)下,人間充質(zhì)干細胞應能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細胞。成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定。


實驗前準備:

      試劑:PBS,成骨誘導分化培養(yǎng)基,茜素紅

      耗材:NEST細胞培養(yǎng)皿,NEST普通吸頭,NEST微量離心管

      設備:CO2培養(yǎng)箱,顯微鏡


一、接種骨髓間充質(zhì)干細胞:

取對數(shù)生長期的細胞,按照2×105cells/cm2的細胞密度接種至包被后的細胞培養(yǎng)皿中,將接種好的細胞培養(yǎng)皿放到37℃,5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),定期觀察細胞增殖狀態(tài),當細胞融合度達60-70%時,棄掉上清,加入成骨誘導分化培養(yǎng)基。

二、細胞分化誘導:

每2-3天進行換液(定期觀察是否有污染),再放入37℃,5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2-3周,并注意觀察細胞形態(tài)變化。根據(jù)細胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況,決定終止細胞誘導的時間,進行下一步染色鑒定。

三、細胞固定:

用吸頭(確保吸取充分)吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次,棄去后取適量4%中性甲醛溶液細胞培養(yǎng)皿底面,室溫固30-60min,棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。

四、茜素紅染色:

加入適量茜素紅染液染3-5min,吸去茜素紅染液,用1×PBS清洗兩次,并加入適量1×PBS避免細胞干燥。

五、誘導評估:

顯微鏡下觀察成骨染色效果,并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時,鈣質(zhì)結(jié)節(jié)會與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。



圖c 間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化,茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)..

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